干粉形式的重组蛋白在常温下能够保持稳定,大多数 MCE 重组蛋白以干粉形式发货。冻干粉在使用前需进行溶解,这时候会常看到一位陌生又熟悉的“朋友”——载体蛋白。
Step 1: 判断实验周期。短期实验<=7 天,溶解材料:复溶缓冲液;长期实验>=7 天,溶解材料:复溶缓冲液、载体蛋白。
Step 2: 开盖前离心。冻干粉在运输过程中,会因为外力因素粘附于管壁或者管盖上,在开盖之前,先通过离心操作,将冻干粉收集于管底,避免损失和浪费。建议 10,000-12,000 rpm 高速离心 30 s;若没有高速离心机,3,000-3,500 rpm 离心 5 min。
Step 3: 短期实验:向冻干粉中加入提供的复溶缓冲液,用枪头轻轻吹打混匀,重悬至浓度不低于 100 μg/mL。分装每管不少于 20 μL.
长期实验:先用复溶缓冲液将蛋白溶解,再用含载体蛋白 (0.1% BSA,5% HSA,10% FBS,或 5% 海藻糖) 的溶液进一步稀释,浓度不低于 100 μg/mL,然后分装冻存于 -20°C 至 -80°C。
蛋白质对热非常敏感,蛋白质冻干可以使蛋白质的大部分活性得以保留,提高蛋白质的稳定性,延长储存时间,同时降低运输成本。但冻干可能导致蛋白质丧失部分活性、聚集和其他退化问题,需通过添加保护剂(稳定剂、添加剂、赋形剂) 和控制各种冻干条件以尽可能减少负面影响。MCE 大部分重组蛋白以冻干粉的形式提供,室温下非常稳定,支持常温运输,为确保蛋白质 100% 的活性,我们通常以冰袋运输,建议收到产品后 -20℃ 或 -80 ℃ 保存。
我应该如何储存重组蛋白?
对于长期储存,蛋白质溶液应与载体蛋白 (例如 0.1% BSA、10% FBS、5% HSA 和 5% 海藻糖) 分装保存,并在 -20°C 至 -80°C 下冷冻保存。在分装冻存前,建议用含载体蛋白的溶液进一步稀释 (浓度不低于 100 μg/mL)。保存产品时请避免反复冻融,每个冷冻-解冻循环都可能导致蛋白质变性和降解。
载体蛋白使蛋白保存更稳定的原理是什么?
塑料管壁对蛋白有很强的吸附作用,会导致重组蛋白粘附在管壁不易分离,进而导致溶液中重组蛋白的实际浓度偏低,最终导致其活性下降。在复溶重组蛋白时,加入载体蛋可以预先封闭塑料管壁上蛋白结合位点,避免重组蛋白粘附于管壁。此外,载体蛋白也能维持蛋白在低温条件下的稳定,使其保持活性。如果在重组蛋白冻干粉复溶后,不用含载体蛋白的溶液进一步稀释,而是直接分装冻存,则溶液中的大部分重组蛋白均会粘附到管壁上,导致溶液中实际溶解的细胞因子或重组蛋白的浓度大大降低,最终表现为重组蛋白活性的下降。
含载体蛋白的溶液指的是什么溶液呢?水可以吗?
为了维持一定的 pH 值跟盐类浓度,避免蛋白不稳定,不建议用水,该溶液通常建议选择 pH 近中性、有一定缓冲能力的缓冲液,如PBS、培养基 (RPMI1640, DMEM 等) 等。
海藻糖 or BSA 怎么选?
一般情况下,用于细胞或组织培养可以使用含有 BSA 载体的重组蛋白。但是,当进行某些实验,如体内实验、蛋白标记时,BSA 可能会干扰实验,则不适合使用添加 BSA 的重组蛋白。另外,如果实验平台有特殊要求,也应根据要求选择不含 BSA 的蛋白。做无血清培养或动物的体内实验时,细胞因子中不能含有 BSA,FBS 或 HSA 等动物或人的蛋白,建议选择5% 海藻糖作为载体蛋白。
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